在臨床檢驗中一般采用商品試劑盒進(jìn)行測定。ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對照品和陽(yáng)性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（5）結合物及標本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應終止液。

1免疫吸附劑
已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡(jiǎn)述固相載體和包被過(guò)程。

1.1固相載體
固相載體在ELISA測定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應?？勺?/span>ELISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱(chēng)為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果?，F在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線(xiàn)照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時(shí)空白值較大。

良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數在吸光度0.8左右。計算全部讀數的平均值。所有單個(gè)讀數與全部讀數的均數之差，應小于10%。

與聚苯乙烯類(lèi)似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪割，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學(xué)測定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標本和陰性標本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較結果。在哪一種載體上陽(yáng)性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。

在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著(zhù)固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過(guò)程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可根據需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。

也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大，反應在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。

1.2 包被的方式
將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結合到固相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上，抗體結合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其后通過(guò)抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法（見(jiàn)2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉?jīng)紫外線(xiàn)照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴(lài)氨酸、魚(yú)精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定。

脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

1.3 包被用抗原
用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物培養物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現假陽(yáng)性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝炎病毒（HCV）尚不能培養成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點(diǎn)為他僅能檢測與其相應的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應。另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結構變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。

1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清中將出現雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋后直接包被，必要時(shí)也可用純化的IgG。應用單抗包被時(shí)應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

1.5 包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應根據試驗的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續與包被相類(lèi)似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長(cháng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會(huì )使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可得到滿(mǎn)意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類(lèi)似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（見(jiàn)2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。

2 結合物
結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當的分子比例，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩定性。

2.1酶
用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉化率高，專(zhuān)一性強，性質(zhì)穩定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結合物后仍繼續保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase, AP)。在少數商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

國產(chǎn)ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(cháng)處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長(cháng)處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥9.0。

HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩定的特點(diǎn)。值得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會(huì )降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產(chǎn)物量的測定進(jìn)行試驗。

國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統的敏感度一般高于HRP系統，空白值也較低，但AP價(jià)格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。

2.2 抗原和抗體
制備結合物時(shí)所用抗體一般均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應，實(shí)驗結果本底淺淡。如用F(ab')2進(jìn)行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。

2.3 結合物的制備
酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。

（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。
ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它

有操作簡(jiǎn)便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

（2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物酶的標記常用此法。反應時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯(lián)結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實(shí)驗結果不易重演。

按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經(jīng)過(guò)徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì )與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開(kāi)。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。

結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當的工作濃度。使用過(guò)濃的結合物，既不經(jīng)濟，又可使本底增高；結合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測的敏感性。所以必須對結合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是指結合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護一個(gè)低的本底，并獲得測定的最佳靈敏度，達到最合適的測定條件和測定費用的節省。就酶標抗體本身而言，它的有效工作濃度是指與其相應抗原包被的載體作試驗時(shí)，能得到陽(yáng)性反應的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng)1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應。但在用于具體的ELISA檢測中，酶標抗體的最適工作濃度受到固相載體的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測系統如標本、反應溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。

2.4結合物的保存
酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。高濃度的結合物較為穩定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復溶，頗為不便。結合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長(cháng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結合物一般均按以上兩種形式供應，配以稀釋液（見(jiàn)3.2.5）臨用時(shí)按標明的稀釋度稀釋成工作液?，F在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)?/span>4-8℃保存期可達6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結合物易失活，需加入蛋白保護劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結合物加硫柳泵，AP結合物可加疊氮鈉），以防止細菌生長(cháng)。

2.5 結合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結合物以配成工作液。為避免結合物在反應中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白），通過(guò)競爭以抑制結合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測定抗體時(shí)，血清標本需稀釋后進(jìn)行測定，也可應用這種稀釋液。

3 酶的底物
3.1 HRP的底物
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O 
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測定。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時(shí)應予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質(zhì)較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長(cháng)為405nm。