ELISA實(shí)驗步驟：

1、試劑準備：根據選擇的試劑盒準備好相關(guān)試劑。

2、樣品準備：血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清、組織標本等。

3、試劑的配置

4、抗體包被：Coating Buffer: 稀釋成Coating Buffer （1×），根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)稀釋抗體，每孔加入100ul預稀釋的抗體，4°C過(guò)夜孵育（16-18h）。

5、使用前，將所有試劑充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。 

6、根據實(shí)驗孔（空白和標準品）數量，確定所需的板條數目。樣品（含標準品）和空白都應做復孔。 

7、加樣：100  μL/well 加入稀釋后的 Cytokine   standard 至標準品孔，100  μL/well 加入樣

品至樣品孔，100  μL/well 加 Dilution buffer R (1×)入空白對照孔。 

8、加檢測抗體：根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)加入 Biotinylated antibody 。 混勻后蓋上封板膜，室溫孵育。 

9、洗板：扣去孔內液體，300 μL/well 加入 1×washing buffer；停留 1 分鐘后棄去孔內液體。重復 3 次，每一次在濾紙上扣干。 

10、加酶：根據產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)加入稀釋好的酶，孵育。 

11、洗板：重復步驟 5 。 

12、顯色：100 μL/well 加入 TMB，室溫（18-25℃）避光孵育5-30分鐘之間，根據孔內顏色的深淺（深藍色）來(lái)判定終止反應。 通常顯色 10-20 分鐘可以達到很好的效果。 

13、終止反應：迅速 100 μL/well 加入 Stop solution  終止反應。

14、讀板：終止后 10 分鐘內，用檢測波長(cháng)（measurement wavelength）450 nm 讀值。推薦用雙波長(cháng)即檢測波長(cháng)（measurement wavelength）450 nm 、參考波長(cháng)或校正波長(cháng)（reference wavelength ）610-630 nm 同時(shí)讀板，測量結果會(huì )更準確。

 

ELISPOT實(shí)驗步驟：

第一天：ELISPOT包被程序，提供兩種方案供選擇（嚴格注意無(wú)菌操作）

方案A: 傳統酒精預濕包被程序 
該方案中，需經(jīng)過(guò)：70％乙醇預濕PVDF膜、無(wú)菌去離子水洗滌去除乙醇、拍干，最后，加入已稀釋好的包被抗體到各實(shí)驗孔完成包被操作。 
具體操作如下： 
1. 實(shí)驗卡片填寫(xiě)：設計好試驗，把每個(gè)孔要加入的內容做成卡片，到時(shí)候就會(huì )從容很多。 
2. 每孔加入15μL 70%的乙醇預濕。

注意： 
未潤濕PVDF膜是潔白、不透明的；經(jīng)乙醇潤濕后，顏色變暗，呈半透明狀，很容易觀(guān)察二者的區別。 
加乙醇時(shí)，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不要刺到PVDF膜。 
若加入的乙醇掛在孔壁上，蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會(huì )在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。 
15μL是經(jīng)過(guò)優(yōu)化的體積，能保證剛好完全浸潤整塊膜，而不會(huì )有剩余。請勿隨意加大用量！ 
膜在潤濕后如果不做處理，大約10min后由于乙醇的揮發(fā)會(huì )重新變干。所以應該在膜變干之前加入去離子水，兩步的時(shí)間間隔不要超過(guò)5min。否則，膜需要重新潤濕。 
3. 洗滌：100μL/孔加入去離子水，洗滌2次。 
本次洗滌目的在于：除去預濕用的乙醇。因此應該盡量洗滌干凈，減少殘留。 
4. 包被：按說(shuō)明書(shū)操作。50μL/孔加入用1×PBS稀釋好的包被抗體，4°C包被過(guò)夜。 
5. 封閉：（次日）傾倒包被液，用無(wú)菌1×PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。200μL/孔加入稀釋好的封閉液，37°C封閉1h。 
6. 傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接加入檢測細胞進(jìn)行ELISPOT檢測。

方案B: Magi? Coating Buffer潤濕包被程序 
該方案中，用Magi? Coating Buffer潤濕PVDF孔后，直接加入用1×PBS稀釋的包被抗體，即可完成抗體的包被。 
1. 實(shí)驗卡片填寫(xiě)：設計好試驗，把每個(gè)孔要加入的內容做成卡片，到時(shí)候就會(huì )從容很多。 
2. 每孔加入15μLMagi? Coating Buffer預濕。

注意： 
未潤濕PVDF膜是潔白、不透明的，經(jīng)Magi? Coating Buffer潤濕后，顏色變亮，呈半透明狀，很容易觀(guān)察二者的區別。 
加Magi? Coating Buffer時(shí)，槍頭應該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不要刺到PVDF膜。 
若加入的Magi? Coating Buffer掛在孔壁上，蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓Magi? Coating Buffer順勢滑落。Magi? Coating Buffer一旦接觸到PVDF膜，就會(huì )在表面張力和毛細作用之下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。 
3. 包被：潤濕之后，無(wú)須洗滌。每孔加入50μL PBS稀釋好的包被抗體，4°C包被過(guò)夜。 
4. 封閉：（次日）傾倒包被液，用PBS洗滌3次。最后一次，在滅菌的吸水紙上扣干。200μL/孔加入用1×PBS稀釋好的封閉液，37°C封閉1h。 
5. 傾倒封閉液，無(wú)須洗滌，直接加入檢測細胞進(jìn)行ELISPOT檢測。

第二天：接種細胞,加入刺激物，培養（嚴格注意無(wú)菌操作） 
整個(gè)實(shí)驗設置1組正對照（PHA刺激），每一個(gè)細胞樣品（同一個(gè)捐獻者或實(shí)驗動(dòng)物）要設1組負對照（不加刺激物），整塊板還要加1組背景負對照（不含細胞，只加培養基和所有檢測試劑）。 
1. 填好實(shí)驗卡片，用以指導實(shí)驗安排及細胞和試劑的添加。每一個(gè)細胞/刺激物的組合設復孔（建議2-4孔，客戶(hù)可根據實(shí)驗要求自行調整復孔數目）。 
2. 取出封閉好的板，準備加入細胞。如果是以前做的封閉，先加入200μL的Lympho-Spot?無(wú)血清培養基室溫靜置10min，然后傾倒。 
3. 細胞上板：按照實(shí)驗卡片的安排，接種不同濃度的細胞，100μL/well，細胞在孔中的分布要盡量均勻（要訣是加入細胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會(huì )讓細胞更分散，實(shí)際情況剛好相反）。 
（1）正對照：細胞濃度為1×104 cells/well。 
（2）細胞樣品：樣品細胞濃度請實(shí)驗者自行摸索調整，通常為1～5×105cells/well。 
（3）背景負對照：加入100μL的Lympho-Spot?無(wú)血清培養基，該孔即為背景負對照孔。 
4. 刺激物：特異性刺激物和非特異性刺激物之分。 
5. 正對照孔加入10μL PHA，終濃度1-4ug/mL，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌。 
6. 加入實(shí)驗者自己的刺激物（用Lympho-Spot?無(wú)血清培養基配制成10×終濃度，10μL/well）到實(shí)驗孔。加完刺激物后不要再拍擊ELISPOT板。有人認為拍擊板子會(huì )讓刺激物在孔中混合均勻。實(shí)際上，通過(guò)擴散，刺激物會(huì )很快混合均勻。拍擊板子會(huì )讓細胞聚集分布在孔的外周。 
7. 加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入二氧化碳培養箱，37°C培養18-24h。

注意： 
碰撞會(huì )引起細胞移位，造成斑點(diǎn)模糊、拖尾。在整個(gè)培養過(guò)程中應避免移動(dòng)、碰撞培養板，并盡量減少開(kāi)關(guān)培養箱的次數。 

第三天：培養后操作（不再需要無(wú)菌操作） 
1. 裂解細胞：傾倒孔內的細胞及培養基，200μL/孔加入冰冷的去離子水，4°C冰浴10min（低滲法裂解細胞）。 
2. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。 
3. 加入檢測抗體：每孔加入100μL稀釋好的生物素標記檢測抗體，37°C孵育1h。 
4. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。

注意： 
有實(shí)驗者認為，洗滌檢測抗體和酶標親和素時(shí)，膜的背面也需要清洗。經(jīng)我們驗證，不清洗膜的背面也完全可以得到滿(mǎn)意的結果，但是如果清洗，背景會(huì )更干凈一些。所以，清洗膜的背面為實(shí)驗的優(yōu)化步驟，是否略過(guò)，由實(shí)驗者自行決定。 
洗滌膜的背面，我們的方法是：在洗滌最后一次時(shí)，將去除塑料保護層的PVDF膜板底面浸入盛有干凈PBST的淺托盤(pán)中，輕輕漂洗幾次即可。 
一定要將膜背面和塑料保護層上的液體甩干后，再合攏，蓋上，不要劃傷到膜。 
5. 加入酶標親和素：每孔加入100μL稀釋好的酶標親和素，37°C 1小時(shí)。 
6. 洗滌：每孔加入200μLPBST，浸泡3-5mins后扣出洗滌液，重復5次。最后一次，在吸水紙上扣干。 
7. 顯色：解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100μL的顯色液，室溫靜置15-45min（在20 -25°C，顯色25min較合適），注意避光。 
8. 待斑點(diǎn)生長(cháng)到適合的大小之后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細小的水珠，之后取下保護層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干。注意不要將板放到烤箱內，防止膜發(fā)脆、破裂。 
9. 將ELISPOT板置于Biosys Bioreader自動(dòng)讀板儀內，調節好合適的參數，斑點(diǎn)計數，并記錄斑點(diǎn)的各種參數，做統計分析。

 

IHC實(shí)驗步驟：

標本：組織標本：石蠟切片（病理切片和組織芯片）、冰凍切片；細胞標本：組織印片、細胞爬片、細胞涂片

操作步驟：

①石蠟切片制作

1、固定：取組織，用PBS沖洗，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內固定12h

2、脫水：倒去固定液，用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水，70%酒精1天，80%酒精過(guò)夜，95%酒精3h，無(wú)水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h

3、透明：1:1無(wú)水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min

4、包埋：（恒溫箱內進(jìn)行）浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58℃）45min，石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蠟（Ⅲ）包埋組織

5、切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成5-7μm，的石蠟帶

6、貼片：將組織石蠟塊在50℃溫水中展片，然后用處理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上

    （洗片：1%HCl浸泡過(guò)夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂膠：防脫劑多聚賴(lài)氨酸）

7、烤片：68℃恒溫箱內烤片2h

②SP三步法

1、脫蠟：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）浸泡，共25min

2、水化：無(wú)水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各2min

3、PBS沖洗2-3次，每次5min

4、阻斷：3%H2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內源性過(guò)氧化物酶活性

5、PBS沖洗2-3次，每次5min

6、抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫

7、PBS沖洗2-3次，每次5min

8、封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體

9、滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過(guò)夜（需在37℃復溫45min）

10、PBS沖洗2-3次，每次5min

11、滴加辣根過(guò)氧化物酶標記的Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置1h，或37℃1h

12、PBS沖洗2-3次，每次5min

13、滴加SP（鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶），室溫或37℃孵育30min-1h

14、PBS沖洗2-3次，每次5min

15、顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞漿呈棕色者判定為陽(yáng)性細胞）

（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然后加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）

（A：DAB  B：H2O2  C：磷酸緩沖液）

16、自來(lái)水沖洗10分鐘終止反應

17、復染：蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化

18、自來(lái)水沖洗10-15min

19、常規脫水、透明、封片（用中性樹(shù)膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上）、鏡檢

③結果分析：每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野（400X），應用圖像分析系統進(jìn)行定量灰度掃描后進(jìn)行分析。

WB實(shí)驗步驟：

1、蛋白樣品的制備：通過(guò)有機溶劑或水溶法制備總蛋白

2、做膠：檢測抗原10－30kd, 用15％分離膠；30－100kd, 用10％分離膠；100－200kd，用7.5％分離膠。

3、跑膠：壓縮膠電壓：80V（10mA）；分離膠電壓：120V（20mA）當溴酚蘭指示劑到達凝膠底部時(shí)，即停止電泳。

4、轉膜：目的蛋白分子80-140kDa時(shí)，膠濃度8%，轉移時(shí)間為1.5-2小時(shí)；目的蛋白分子25-80kDa時(shí)，膠濃度10%，轉移時(shí)間為1.5小時(shí)；目的蛋白分子15-40kDa時(shí)，膠濃度12%，轉移時(shí)間為0.75小時(shí)；目的蛋白分子＜20kDa時(shí)，膠濃度15%，轉移時(shí)間為0.5小時(shí)；

5、封閉：脫脂奶粉（5％）、BSA、Western Blot 膜封閉液

6、一抗雜交：5％奶粉或2％BSA稀釋抗體（稱(chēng)一抗），稀釋比例按抗體說(shuō)明,室溫孵育1hr，TBST 洗5 mins 3-5 次。

7、二抗雜交：將膜跟5％奶粉或2％BSA稀釋的2 抗一起孵育，室溫1hr。TBST 洗5 mins 3-5 次。

8、底物顯色：

 

流式實(shí)驗步驟：

一、流式胞內細胞因子染色步驟

固定：

1. 在進(jìn)行胞內染色之前（如：IFN-r或者IL-4），可根據BioLegend 細胞表面熒光染色步驟染表面標記，然后用Fixation Buffer (Cat：420801)固定細胞，每管0.5m l固定液，室溫避光孵育固定20min。

2. 350g，離心，5 minutes，棄上清。

3. 如果有中止實(shí)驗的需要，可在此步暫停，保存細胞一段時(shí)間，以備將來(lái)繼續操作實(shí)驗。用Cell Staining Buffer洗一遍細胞，350g，離心，5 minutes，棄上清。Cell Staining Buffer重懸細胞，可在4°C短期保存?；蛘哂?0% FCS/10% DMSO 在-80度較長(cháng)期保存（注：針對固定后且無(wú)表面染色標記的細胞長(cháng)期保存）?；罨娜薖BMC 的細胞因子的表達量會(huì )因供者的不同有所變化。因此 如果想縱向比較，凍存過(guò)的細胞來(lái)源于同一個(gè)供者較好。    

破膜：

4. 稀釋10X的Permeabilization Wash Buffer (Cat. No. 421002)成1X的工作液

5. 用Permeabilization Wash Buffer重懸固定的細胞，350 g 離心 5-10 minutes，棄上清。

6. 2次重復步驟5。

胞內染色：

7. 100ul Permeabilization Wash Buffer 重懸固定破膜后的細胞，加入特定的熒光標記抗體（抗體量根據說(shuō)明書(shū)加），室溫避光20min。

8. 用 2 ml Permeabilization Wash Buffer 把細胞洗兩遍。350 g離心 5 minutes，棄上清。

9. 如果一抗是生物素標記的，接下來(lái)就要加鏈霉親和素偶聯(lián)的二抗。再用Permeabilization Wash Buffer 洗2遍，350 g離心 5 minutes。

10. 用0.5 ml Cell Staining Buffer 重懸固定染色后的細胞，上機檢測分析。

全血標本活化和胞內染色步驟：

1. 用無(wú)菌的組織培養液 1:1 稀釋肝素抗凝的全血。

2. 可用抗原或者絲裂原體外刺激細胞。如果打算做胞內抗原如IFN-γ 或IL-4 ，添加蛋白轉運抑制劑很關(guān)鍵，如brefeldin A (Cat. No.420601) 或者 monensin (Cat. No. 420701)。在添加適量的胞內刺激劑后，把全血分裝到12 x75 mm的塑料培養管中，每管200ul，5% CO2 ，37°C，孵箱孵育4-6小時(shí)。

3. 加入2ml紅細胞裂解液(Cat： 420301)，室溫孵育5-10min。

4. 350 g 離心 5 minutes，棄上清。

5. 用Cell Staining Buffer再把細胞洗一遍，然后進(jìn)行表面熒光染色。

6. 固定細胞，破膜，根據上面所描述的進(jìn)行胞內抗原染色。

二、細胞表面抗原流式染色步驟

組織或細胞收集：

1．獲取實(shí)驗的組織（脾臟、淋巴結、胸腺、骨髓），然后制備單細胞溶液，buffer用的是細胞染色液cell staining buffer（BioLegend Cat#420201）。如果是體外刺激培養的細胞，可簡(jiǎn)單的用cell staining buffer重懸已刺激的細胞，再進(jìn)行步驟2。

2．添加細胞染色液到分離管至15ml，然后350g離心，5 min，棄上清。

紅細胞裂解：

3．如果做的組織是脾臟，需要裂解紅細胞。首先把10X的紅細胞裂解液10X Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer (BioLegend Cat#420301)用去離子水配制成1X工作液。向管中加入3ml紅細胞裂解液重懸細胞，冰上孵育5min。

4．向管中加入10ml 細胞染色液以終止裂解作用。然后350g離心，5 min，棄上清。

5．重復步驟2洗細胞一遍。

6．活細胞計數后，加細胞染色液調整細胞數濃度在5-10 x 10^6cells/ml，以每管100ul的細胞液分裝到流式管中，這樣細胞數濃度接近于5-10 x 10^5cells/ml

FC受體阻斷：

7．FC受體的阻斷試劑可以有效的減少非特性的熒光染色。對小鼠標本，用anti-mouse CD16/CD32純化抗體(針對Fcγ R III/II，BioLegend cat#101302, clone 93)，能阻斷非特異的受體。加入5-10ug/ml的 anti-mouse CD16/CD32，冰上預孵育細胞10min，就可以了。由于沒(méi)有用于人和大鼠的阻斷FC的抗體，一個(gè)可選的方案就是用過(guò)量的不相關(guān)的純Ig預孵育阻斷。

細胞表面染色抗體：

8．加入適量的有熒光標記的、生物素化或者純化的一抗（如： anti-CD3-FITC、anti-CD4-Biotin、anti-CD8-APC)到已準備好的細胞懸液里。 冰上暗處孵育15-20min。

9．加入至少2ml的細胞染色液洗2次，350g離心，5 min，棄上清。

10．如果先前加入的是純化的一抗，則用管中殘留的buffer 重懸細胞，再加入針對特定免疫球蛋白的熒光標記的二抗。二抗需是預先滴定到最佳濃度，且是抗一抗抗體種屬來(lái)源并聯(lián)有熒光的免疫球蛋白。例如：FITC-anti-mouse Ig。加入后冰上避光孵育15-20min。

如果先前加入的是生物素標記的一抗，則用管中殘留的buffer 重懸細胞，再加入熒光SAv試劑。需是預先滴定到最佳濃度，連接有熒光素的SAv試劑。比如：SAv-PE.（BioLegend Cat# 405204）。加入后冰上避光孵育15-20min。

11．重復步驟 9.

12．加入0.5ml的Cell Staining Buffer重懸細胞，再加入5ul（含0.25ug/ million cells）的7-AAD活性染色劑(BioLegend cat#420403) 來(lái)排除死細胞。注意：BioLegend不建議使用7-AAD時(shí)合用PE/Cy5、 PerCP、或 PerCP/Cy5.5等染料。

13．冰上暗處孵育3-5min。

14．流式細胞儀分析。

全血標本的流式染色方案：

1．每管準備100ul 抗凝全，再加入預先滴定到最佳濃度的鏈有熒光素、生物素或者是純化的一抗。

2．室溫避光孵育15-20min。

3．把10X的紅細胞裂解液(BioLegend Cat #420301)用去離子水配制成1X工作液，使用前室溫平衡。每管（100ul全血，已孵育抗體）加2ml 的1X的紅細胞裂解液，混勻，室溫避光孵育10min。

4．350g離心，5 min，棄上清。

5．用至少2ml的Cell Staining Buffer洗一遍，350g離心，5 min，棄上清。

6，如果先前加入的是純化的一抗，則用管中殘留的buffer 重懸細胞，再加入針對特定免疫球蛋白的熒光標記的二抗。二抗需是預先滴定到最佳濃度，抗一抗種屬并聯(lián)有熒光的免疫球蛋白。比如說(shuō)：FITC-anti-mouse Ig，加入后冰上避光孵育15-20min。

如果先前加入的是連有生物素的一抗，則用管中殘留的buffer重懸細胞，再加入熒光SAv試劑。需是預先滴定到最佳濃度，連接有熒光素的SAv試劑。比如：SAv-PE.。加入后冰上避光孵育15-20min。

7．重復步驟5。

8．加入0.5ml的Cell Staining Buffer重懸細胞或者0.5ml含2%多聚甲醛的PBS固定液。

9．上流式分析。